完成单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所

    完成人：叶星、孙成飞、董浚键、可小丽、刘志刚、黎炯、高风英、张德锋、卢迈新、田园园、魏远征、瞿兰

    成果简介：罗非鱼是联合国粮农组织向世界推荐的优良养殖品种。中国为罗非鱼主养国，养殖产量和出口量稳居世界首位，产量占世界罗非鱼总产量的近50%。但由于养殖密度高、养殖环境恶化等原因，近年罗非鱼爆发链球菌病，造成巨大经济损失并威胁着罗非鱼养殖业的健康发展。

    本项目组在2009年罗非鱼爆发病开始时即投入开展相关研究，取得的主要成果如下：

    1、率先在广东及海南罗非鱼主养区的病鱼体中分离、鉴定并证实引发罗非鱼爆发病的致病菌为无乳链球菌（Streptococcus agalactiae，GBS），并确定其分子血清型为MSIa, ST-7型；同时建立双重PCR 法快速鉴别GBS 与海豚链球菌，以及基于环介导等温扩增技术的GBS快速检测技术并开发检测试剂盒。相关研究结果为快速制定安全有效的罗非鱼病害防控措施及疫苗研制提供依据。

    2、开展罗非鱼无乳链球菌的分子特征和流行规律分析，发现在248 株GBS中92.3%的GBS株分子血清型是Ia 型, 其余7.7%为Ib 型；所有Ia 型GBS均为ST-7 型而所有Ib 型都是ST-261 型，说明近年我国罗非鱼GBS已发生了明显的遗传变异。相关研究为罗非鱼链球菌病的疫苗研制和综合防治防控提供科学依据。

    3、开展病原菌与宿主相互作用分子机制研究：1）首次证实罗非鱼Siglecs与GBS荚膜唾液酸多糖的结合活性；2）证实GBS利用其荚膜唾液酸多糖与宿主Siglecs like受体相互作用，抑制了宿主的免疫反应，实现免疫逃脱；3）构建荚膜唾液酸多糖缺失株，证实neuA基因是GBS荚膜多糖唾液酸化的关键基因，其缺失导致荚膜唾液酸含量降低且显著降低菌株毒力。致病机制的研究可为GBS疫苗研制、抗病药物及抗病育种提供新思路。

    4、开展罗非鱼GBS 多个表面蛋白的免疫原性研究，建立乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球疫苗制备方法并评估其保护作用：1）比较了罗非鱼GBS scpB、LrrG和sip重组蛋白及LrrG-Sip 重组融合蛋白的免疫保护作用，发现LrrG-Sip 重组融合蛋白的相对免疫保护率最高，表明融合蛋白的免疫原性明显优于单个蛋白，且可有效减少免疫剂量；2）用PLGA包裹GBS制备口服疫苗免疫罗非鱼可增强鱼的免疫反应，并通过缓释作用使机体维持较高的抗体水平，表明PLGA-LrrG蛋白微球具有潜在的口服免疫应用价值。相关研究为罗非鱼GBS新型疫苗开发奠定了坚实基础。

    5、开发新的转基因介导技术并应用于抗病转基因罗非鱼的培育：1）开发金鱼Tgf2转座子、巨核酸酶I-Sce I介导的转基因技术，发现二者均可提高斑马鱼基因转植效率与整合率；2）利用标记蛋白gfp基因与Tgf2转座子系统，证实罗非鱼Hsp70基因的启动子具有热诱导和细菌诱导的转录活性；3）比较6种鱼虾重组溶菌酶活性，选取具较强溶菌活性的罗非鱼C3溶菌酶作为转植靶基因；4）构建了基于Tgf2转座子系统、罗非鱼Hsp70启动子驱动的C3溶菌酶基因的全鱼转基因元件，显微注射获得转溶菌酶基因罗非鱼F1-F3代，并已获纯系F3代。转C3溶菌酶罗非鱼F2具有较高的转植基因表达水平、抗病力显著提高；５）“转c-type lysozyme 3 基因抗病尼罗罗非鱼珠研１号”已获得农业农村部“转基因生物中间试验”批文。通过进一步扩大培育及相关生物安全评估，有望为罗非鱼养殖业提供抗病品系，促进罗非鱼养殖业的健康可持续发展。

    6、本项成果发表论文40篇，其中 SCI期刊发表论文11篇，CSCD论文29篇，获国家发明专利2件，实用新型专利1件。